Consideracions clau de disseny per als protocols d'estudi de validació de l'eliminació viral de productes de teràpia gènica

ICH Q5A(R2)-Fundació d'Harmonització Internacional

ICH Q5A(R2) es va adoptar oficialment l'1 de novembre de 2023 i representa el document d'orientació internacional bàsic per a l'avaluació de la seguretat viral. En comparació amb la Q5A(R1) publicada el 1999, les actualitzacions significatives de la versió R2 inclouen: un capítol recentment afegit sobre l'avaluació de la seguretat viral en la fabricació contínua (Capítol 7); un paper reforçat de l'avaluació del risc com a base de les estratègies d'eliminació viral; incorporació de la-seqüenciació de propera generació (NGS) en consideracions de detecció viral; i requisits explícits per a l'avaluació de nous productes i processos de fabricació. Q5A(R2) ha estat adoptat per les autoritats reguladores com la FDA, EMA i PMDA, proporcionant un marc tècnic unificat per a la validació de l'eliminació viral a tot el món.

NMPA-Sistema de regulació xinès

El marc regulador de la NMPA per a la seguretat viral cobreix diversos nivells:

Nivell de document	Nom del document	Any d'emissió
Document fundacional	Directrius tècniques per a l'eliminació/inactivació de virus dels productes sanguinis	2002
Document fundacional	Principis generals per a la revisió tècnica de l'avaluació de la seguretat vírica de teixits biològics-productes derivats i de cèl·lules eucariotes-productes expressats	2005
Directriu-específica del producte	Directrius tècniques per a la investigació farmacèutica i l'avaluació d'aplicacions d'assaigs clínics per a vectors de virus associats adeno-recombinants (rAAV)-basats en productes de teràpia gènica Vivo	2023
Directriu-específica del producte	Requisits tècnics comuns per a la qualitat farmacèutica del vector de virus adeno-associat recombinant (rAAV)-basat en productes de teràpia gènica Vivo per a sol·licituds d'autorització de comercialització	2025
Pauta innovadora	Directrius tècniques per a la validació de plataforma de processos d'eliminació viral per a aplicacions d'assaigs clínics de productes proteics recombinants terapèutics (assaig)a	2024

a: Aquesta directriu representa la primera vegada que l'autoritat reguladora xinesa estableix requisits tècnics sistemàtics per a la validació de la plataforma dels processos d'eliminació de virus, i està alineada amb l'esperit d'ICH Q5A(R2).

Requisits reguladors de la FDA i de l'EMA-EUA i Europa

La FDA va emetre formalment un document d'orientació de la indústria basat en ICH Q5A(R2) el gener de 2024. A més, el capítol de la Farmacopea dels Estats Units (USP)<1050.1>proporciona una guia tècnica addicional sobre el disseny, l'avaluació i la caracterització dels procediments d'eliminació viral. La FDA organitza un Simposi d'eliminació viral cada dos anys; el simposi de 2023 va abordar temes-vanguardistes com ara noves modalitats, fabricació contínua, nous mitjans de cromatografia i filtres adsortius. Els documents d'orientació bàsics de l'EMA inclouen CPMP/BWP/268/95 (Nota per a la guia sobre els estudis de validació de virus: el disseny, la contribució i la interpretació dels estudis que validan la inactivació i l'eliminació de virus) i EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Guideline on Virus Safety Evaluation of Medicinal Safety), que han estat tots dos harmonitzat amb ICH Q5A(R2).

Identificació de fonts de contaminació viral

ICH Q5A(R2) subratlla que el disseny de la validació de l'eliminació viral s'ha de basar en una avaluació integral del risc. Per als productes de teràpia gènica, la identificació de fonts de contaminació viral hauria de tenir en compte els nivells següents:

Nivell del banc cel·lular: virus endògens (p. ex., partícules retrovirals) i virus latentment infecciosos potencialment albergats en els substrats de les cèl·lules de producció (p. ex., HEK293, CHO, HeLa). Se sap que les cèl·lules HEK293 contenen seqüències endògenes Ad5 E1 i un fragment d'EBV d'aproximadament 900 pb, i són capaços d'expressar adenovirus-competents per a la replicació; per tant, s'ha de prestar especial atenció a aquest risc en l'avaluació del risc.

Nivell de virus auxiliar: la producció de vectors AAV normalment empra mètodes com ara la triple transfecció mitjançant plasmidis auxiliars, que comporten el risc de generar adenovirus-competents de replicació (RCA). De la mateixa manera, les cèl·lules empaquetades utilitzades en la producció de vectors lentivirals poden generar lentivirus-competents de replicació (RCL).

Nivell de matèries primeres: els virus adventius es poden introduir a través de les matèries primeres utilitzades en la fabricació, inclosos els medis de cultiu cel·lular, els pinsos i els enzims. Aquest risc és especialment significatiu quan s'utilitzen components d'origen animal-(per exemple, sèrum fetal boví, solucions de digestió de tripsina).

Diferències de risc: teràpia gènica versus proteïnes recombinants tradicionals

Dimensió de risc	Productes tradicionals de proteïnes recombinants	Productes de teràpia gènica
Font viral	Virus endògens del banc de cèl·lules; virus adventius	Virus del banc cel·lular; virus auxiliars; vectors{0}}competents de replicació (RCV/RCL); integració del genoma hoste
Substrat cel·lular	CHO, NS0, Sp2/0 i altres línies cel·lulars-ben caracteritzades	HEK293, HeLa, CHO, etc.; algunes línies cel·lulars són d'origen tumorigènic
Característiques del producte	Medicament basat{0}}en proteïnes; estructura ben-definida	vector viral; comporta riscos de bioseguretat
Estratègia de validació	Eliminació viral de diversos-passos; èmfasi en la validació de les etapes del procés	Es requereix detecció de RCV/RCL; la validació i les proves són essencials
Validació de la plataforma	Aplicable a processos establerts com S/D, pH baix, nanofiltració	Aplicabilitat limitada a causa de la diversitat de tipus de vectors

Taula 1. Comparació dels riscos de seguretat viral: productes de teràpia gènica versus productes proteics recombinants tradicionals

Principis generals

La selecció de virus indicadors és un element central en el disseny dels protocols de validació d'eliminació viral. ICH Q5A(R2) requereix que la selecció de virus indicadors es basi en l'avaluació del risc i tingui en compte els factors següents:

Rellevància del virus per al substrat de la cèl·lula de producció (virus rellevant)

Propietats fisicoquímiques del virus (envoltat/no{0}}embolcallat, ADN/ARN, rang de mida)

Resistència del virus als tractaments físics/químics

Detectabilitat i bioseguretat del virus

Per als productes de teràpia gènica, la selecció de virus indicadors ha de tenir en compte addicionalment: el paper del propi virus vector com a "virus rellevant"; el risc potencial de contaminació del virus auxiliar; i els requisits de detecció i validació per a virus de replicació-competents (RCV/RCL).

Panell de virus indicadors recomanat

Virus	Tipus	Sobre	Genoma	Mida (nm)	Justificació / Aplicació de la selecció
MVM	Parvovirus	Cap	ssDNA	18–26	Model sense -embolcall; mida més petita i màxima resistència; adequat per a la validació de nanofiltració (generalment no s'aplica als productes vectorials rAAV)
PPV	Parvovirus	Cap	ssDNA	18–26	Model sense -embolcall; virus indicador d'ús habitual per a productes sanguinis
Reo-3	Reovirus	Cap	dsRNA	60–80	Model sense -embolcall; mida mitjana; alta estabilitat física
PRV	Herpesviridae	Sí	dsDNA	150–200	Model envoltat; mida gran; àmplia gamma d'hostes
X-MuLV	Retrovirus	Sí	ssRNA	80–110	Model de retrovirus envoltat; adequat per a substrats cel·lulars derivats de CHO-
BVDV	Flaviviridae	Sí	ssRNA	40–60	Model envoltat; S'utilitza per avaluar mètodes d'inactivació química (substitut del VHC)
VSV	Rhabdoviridae	Sí	ssRNA	70	Model envoltat; àmplia tolerància al pH; adequat per a la validació d'inactivació de -pH baix

Taula 2. Panell de virus indicadors recomanat per a la validació de l'eliminació viral dels productes de teràpia gènica

Consideracions especials per als productes vectorials AAV

Per als productes de vectors AAV recombinants, les directrius tècniques de la NMPA per a la investigació farmacèutica i l'avaluació d'aplicacions d'assaigs clínics per a productes de teràpia gènica basats en rAAV vector-in vivo requereixen atenció a la detecció d'AAV-competents de replicació (rcAAV). rcAAV es refereix a AAV capaç de replicar-se autònomament, que normalment sorgeix de la recombinació homòloga entre el plasmidi auxiliar i el genoma del producte AAV. La detecció de rcAAV es realitza generalment mitjançant assaigs infecciosos o mètodes de qPCR, realitzats per separat sobre la substància del fàrmac i el producte purificat.

Val la pena assenyalar que els processos de purificació aigües avall dels productes vectorials AAV inclouen normalment la digestió de nucleases, la cromatografia (AEX), la nanofiltració i la cromatografia d'intercanvi iònic (CEX/IEX). En la validació tradicional d'eliminació viral, aquests passos del procés poden provocar pèrdues significatives del propi vector AAV; per tant, la interacció entre els virus vectors i indicadors s'ha de considerar acuradament durant el disseny del model a escala-reduïda. Per a determinades etapes del procés (per exemple, nanofiltració) on les pèrdues de vectors AAV són substancials, s'hauria d'avaluar si es garanteixen els ajustos del procés en funció de les dades de validació (per exemple, l'ajust de la mida dels porus de la membrana de nanofiltració).

Principis generals

El model d'escala-down (SDM) és l'eina bàsica per a la validació de l'eliminació viral; el seu disseny ha de representar amb precisió el rendiment d'eliminació viral del procés de fabricació. ICH Q5A(R2), secció 6.2.2, requereix explícitament que el model de reducció-manti la coherència amb el procés de fabricació en paràmetres clau. Per als productes de teràpia gènica, les consideracions següents són especialment importants en el disseny de SDM:

Representativitat dels paràmetres crítics del procés

El model de reducció-ha de ser coherent amb el procés de fabricació en els paràmetres següents: condicions cromatogràfiques (composició del tampó, pH, conductivitat); relació de càrrega (relació de massa de proteïna vector/sobrenedant); temps de contacte i temperatura; cabal/temps de residència; puresa i composició del producte. Per als productes AAV, també s'hauria d'abordar específicament l'efecte de la distribució de la mida de les partícules del vector i el contingut de la càpsida buida sobre el rendiment de la nanofiltració.

Model de Requisits de Qualificació

ICH Q5A(R2) requereix una qualificació adequada del model de reducció-, que inclou: comparació d'atributs de qualitat del producte (p. ex., puresa, recuperació, densitat); qualificació de la consistència dels paràmetres crítics del procés; i garantir que el model de reducció-redueixi la variabilitat del procés de fabricació. Per als passos de cromatografia, s'ha de qualificar la consistència del perfil del pic, l'elució i el rentat; Per als passos de nanofiltració, s'han de verificar els efectes de la capacitat de volum i la composició del producte.

Fórmula de càlcul LRV

El valor de reducció logarítmica (LRV) és la mètrica bàsica per mesurar l'eficàcia de l'eliminació viral. ICH Q5A(R2), secció 6.5, proporciona una descripció detallada dels mètodes de càlcul de LRV i el tractament estadístic. La fórmula bàsica de càlcul del LRV és: LRV=log₁₀(N₀/N), on N₀ és el títol inicial del virus després de l'augment del virus i N és el títol del virus residual després del tractament del procés. Quan el títol del virus residual cau per sota del límit de detecció de l'assaig, s'han d'utilitzar mètodes d'estimació com la distribució de Poisson (p. ex., proves de gran-volum).

Aplicació d'Intervals de Confiança

Tant ICH Q5A(R2) com EMA CPMP/BWP/268/95 requereixen una avaluació de l'interval de confiança dels resultats del càlcul de LRV. Normalment s'aplica un interval de confiança del 95%.

Criteris d'eficàcia

D'acord amb les directrius tècniques de l'NMPA per a l'eliminació/inactivació de virus dels productes sanguinis, una reducció de virus superior o igual a 4 registres indica que el pas del procés és eficaç per a l'eliminació/inactivació del virus. Tanmateix, aquest criteri no és un llindar absolut i s'ha d'avaluar de manera holística juntament amb les corbes cinètiques d'inactivació, la justificació científica de la selecció de virus indicadors i la solidesa general del disseny del protocol de validació. Per als productes de teràpia gènica, s'ha de prestar especial atenció a la capacitat d'eliminació acumulada en tots els passos del procés per garantir que el perfil general de seguretat viral estigui a un nivell acceptable.

Aplicació i reptes de la nanofiltració

La filtració-retentiva de virus (nanofiltració) és un pas crític d'eliminació viral en la purificació posterior dels productes de teràpia gènica. Els filtres de retenció de virus-típics tenen una mida de porus d'aproximadament 20 nm. El mecanisme d'eliminació viral de la nanofiltració es basa principalment en l'exclusió basada en la mida-, i pot eliminar efectivament la majoria de virus més grans que la mida dels porus de la membrana, inclosos els parvovirus petits no-com ara MVM i PPV.

Tanmateix, la nanofiltració per a productes de teràpia gènica s'enfronta a reptes únics: la mida dels vectors AAV (aproximadament 20–26 nm) és similar a la de certs virus indicadors (per exemple, MVM, 18–26 nm), cosa que pot provocar una reducció de la recuperació del vector; les càpsides buides poden afectar el flux de filtració i l'eficiència de retenció viral; La viscositat de la mostra pot augmentar significativament amb la concentració del vector. Per tant, el disseny SDM per a la validació de la nanofiltració hauria de tenir en compte plenament els efectes de la distribució de la mida de les partícules del vector i el contingut de la càpsida buida sobre el rendiment de la filtració, i s'hauria de tenir en compte l'ús de membranes de nanofiltració amb mides de porus més grans segons correspongui.

Avaluació de l'eliminació viral dels passos de la cromatografia

La cromatografia d'intercanvi iònic (IEX) és un pas bàsic en els processos de purificació de productes AAV, normalment utilitzant la digestió de nucleases seguida de la cromatografia d'intercanvi d'anions (AEX) per capturar càpsides buides i defectuoses, o la cromatografia d'intercanvi catiònic (CEX) per a la purificació fina de càpsides completes. Els mecanismes d'eliminació viral en els passos de la cromatografia inclouen l'exclusió de la mida, les interaccions electrostàtiques, les interaccions d'afinitat i altres factors. Les discussions al Simposi d'eliminació viral de la FDA 2023 van destacar que l'eficàcia de l'eliminació viral dels passos de cromatografia està influenciada per múltiples factors, com ara la capacitat de càrrega, el pH, la conductivitat i el cicle de la resina; s'hauria d'adoptar un enfocament de disseny ortogonal multi-per a una avaluació integral.

Control de seguretat viral en fabricació contínua

El nou capítol 7 d'ICH Q5A(R2) estableix requisits específics per a l'avaluació de la seguretat viral en la fabricació contínua. Per als productes de teràpia gènica, la fabricació contínua s'ha convertit en una direcció de desenvolupament important, però també introdueix nous reptes de seguretat viral. Les estratègies de control de seguretat viral en la fabricació contínua inclouen:-filtres de barrera antivirus en línia com a mesures de contenció crítiques; disseny adequat dels temps de residència i dels fluxos de procés; incorporació de passos d'inactivació amb temps de retenció definits; i una aplicació millorada de la tecnologia analítica de processos (PAT) per al seguiment en temps real-de paràmetres crítics del procés.